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2021年10月15日，客服中心反饋某集團客戶有藥物篩選的研發(fā)測試需求，通過研究30種中藥提取物對神經(jīng)細胞TRVP1通道的抑制影響，從而驗證植物提取物是否具有止癢、止痛效果。生物實驗室工程師第一時間與客戶進行詳細溝通，情況如下：

客戶背景

某集團公司從一個資產(chǎn)不足300萬元的生產(chǎn)企業(yè)成長為一個總資產(chǎn)76.3億多，總銷售收入逾100億元（2010年末），經(jīng)營涉及化學(xué)原料藥、化學(xué)藥制劑、中成藥、中藥材、生物制品、保健食品、化妝品及飲料的研制、生產(chǎn)及銷售；醫(yī)療器械（二類、醫(yī)用敷料類、一次性使用醫(yī)療衛(wèi)生用品），日化用品等領(lǐng)域的云南省實力最強、品牌最優(yōu)的大型醫(yī)藥企業(yè)集團。

樣品名稱

中藥提取物

客戶需求

客戶研究目的是對原料中藥進行藥物靶點篩選，通過細胞毒性測試、膜片鉗、鈣成像等技術(shù)手段，從多種提取物種篩選出能搞有效抑制TRVP1靶點的樣品，進行后續(xù)下游的工藝研發(fā)生產(chǎn)。

解決方案

簽訂合同后，生物醫(yī)藥實驗室先進行查閱大量文獻，進行總體方案設(shè)計。TRPV1通道蛋白在廣泛表達于Aδ-纖維及C-型纖維等皮膚感覺神經(jīng)纖維上，激活感覺神經(jīng)元上TRPV1受體，可產(chǎn)生疼痛、灼熱及瘙癢感，并引起P物質(zhì)(Substance P，SP)和降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin Gene Related Peptide，CGRP)等促炎介質(zhì)的釋放，介導(dǎo)神經(jīng)源性的炎癥，最終導(dǎo)致多種皮膚病和瘙癢癥的發(fā)生。該發(fā)現(xiàn)獲得了 2021年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲獎。本次實驗就針對TRPV1靶點，?進行3個主要藥效學(xué)實驗，詳情如下。

細胞毒性測試：

CCK-8試劑在電子載體1-甲氧基 -5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物（Formazan），生成的甲臜物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。該方法已被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞增殖試驗、細胞毒性試驗以及藥敏試驗等。

測試中，對樣品設(shè)置6-8個濃度梯度，利用DRG細胞進行30種中藥提取物樣品的細胞毒性測試， 根據(jù)酶標儀原始讀數(shù)計算樣品特定濃度下的細胞活力，從而計算出樣品對細胞的半致死濃度（CC50），評價藥物對細胞的毒性作用。經(jīng)過該項測試，選取細胞活力為80%的樣品濃度作為后續(xù)實驗的測試最高濃度開展項目實驗。

膜片鉗：

膜片鉗又稱單通道電流記錄技術(shù)，用特制的玻璃微吸管吸附于細胞表面，可測量單個離子通道開放產(chǎn)生的pA量級的電流，這種通道開放是一種隨機過程。通過觀測單個通道開放和關(guān)閉的電流變化，可直接得到各種離子通道開放的電流幅值分布、開放幾率、開放壽命分布等功能參量，并分析它們與膜電位、離子濃度等之間的關(guān)系，廣泛用于藥物對離子通道受體抑制作用的測試。

測試中，在室溫下用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄相應(yīng)激動劑誘發(fā)的通道電流。玻璃微電極由玻璃電極毛胚（BF150-86-10，Sutter）經(jīng)拉制儀（P97，Sutter）拉制而成，灌注電極內(nèi)液后的尖端電阻為2-5 MΩ左右，將玻璃微電極插入放大器探頭即可連接至膜片鉗放大器。鉗制電壓和數(shù)據(jù)記錄由pClamp軟件通過電腦控制和記錄，采樣頻率為10 kHz，濾波頻率為2 kHz。在得到全細胞記錄后，細胞鉗制在0 mV，300 ms斜坡電壓從-100 mV至+100 mV，每2 s施加此電壓刺激并給予激動劑誘發(fā)通道電流，電流誘發(fā)40 s以上并確定無衰減后開始給藥過程。每個測試濃度至少給予20 s。數(shù)據(jù)分析處理采用pClamp，GraphPad Prism 5和Excel軟件。不同化合物濃度對TRPV1通道電流（+100 mV時誘發(fā)的電流幅度）的抑制程度用以下公式計算：

Inhibition % = [1 –（I / Io）] × 100%

其中，Inhibition % 代表化合物對電流的抑制百分率，I和Io分別表示在加藥后和加藥前電流的幅度，評價中藥提取物樣品對該通道的抑制作用。

鈣成像：

用熒光探針標記樣本中的鈣離子,根據(jù)樣本中的熒光探針特性單色光源發(fā)出單色光,誘發(fā)出熒光。然后根據(jù)傳感器檢測到的熒光特性即可分析樣本中的鈣離子濃度。探針與鈣結(jié)合后不僅產(chǎn)生熒光強度的變化，從而檢測細胞中鈣離子的濃度變化。

采用高內(nèi)涵蔡司熒光顯微鏡儀器進行熒光信號記錄，20倍的物鏡，曝光100 ms和200 ms各記錄1次加激動劑刺激前的，然后開始加入5激動劑化合物，測試樣品熒光強度的變化。

客戶反饋

在測試過程中和客戶保持溝通，雖然在細胞復(fù)蘇、培育階段出了一點問題，但是客戶總體比較滿意。